Mise au point d'un système chromatographique permettant de détecter en ligne la présence d’inhibiteurs de l’acétylcholinestérase et de comparer qualitativement leurs activités inhibitrices - Département Recherches Subatomiques Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2019

Online acetylcholinesterase inhibition evaluation by high-performance liquid chromatography–mass spectrometry hyphenated with an immobilized enzyme reactor

Mise au point d'un système chromatographique permettant de détecter en ligne la présence d’inhibiteurs de l’acétylcholinestérase et de comparer qualitativement leurs activités inhibitrices

Résumé

The project focuses on the development of a chromatographic system coupling high-performance liquid chromatography (HPLC), immobilized enzyme reactor (IMER) and mass spectrometry (MS) detection to detect acetylcholinesterase (AChE) inhibitors and compare their respective inhibitory activities. Using this device, the AChE inhibitors can be separated on-line and their inhibitory activities can be compared directly by the simple measurement of the chromatographic peaks of the residual acetylcholine (ACh) on MS whose hydrolysis was inhibited by the desired compounds. 3 wildly known standards of AChE inhibitors (Galanthamine-GL, Huperzine A-HuA and Tacrine-TA), were selected to develop the analytical conditions of this coupling. After having validated this method with the 3 AChE inhibiting standards, the alkaloid extracts of different plants were injected into the device in order to screen the new AChE inhibitor candidates. Among the injected extracts, some AChE inhibitors could be discovered thanks to the presence of ACh peaks. To compensate for the drift of the chromatographic baseline (m/z 146), due to the organic phase gradient (MeOH), a counter-gradient pump was added to the outlet of the HPLC column. The results show that this addition of a counter-gradient pump considerably improves the horizontality of the baseline but raises it to high values and reduces correspondingly the sensitivity of the device compared to the chromatographic method performed without counter-gradient. This study led to the development of an innovative method by coupling HPLC, IMER and MS detection for AChE inhibitor screening. Thanks to this method, the activity of the various inhibitors can be easily evaluated by measuring the area of the ACh peaks corresponding to the desired compounds. 3 known AChE inhibitors were chosen to validate this method and have clearly demonstrated a growing dose-response relationship that binds peaks of ACh according to the injected AChE inhibitor amounts. This method CLHP-IMER-SM was applied to screening for AChE inhibitors in plant extracts. Thanks to this method, a new AChE inhibitor has possibily been discovered in the Lycoris Radiata extract.
Notre projet porte sur la mise au point d’un système chromatographique couplant la chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP), un réacteur d’enzyme immobilisée (IMER) et une détection par spectrométrie de masse (SM) destiné à détecter les inhibiteurs de l’acétylcholinestérase (AChE) et de comparer leurs activités inhibitrices respectives. En utilisant ce couplage, les inhibiteurs d’AChE peuvent être séparés en ligne et leurs activités inhibitrices comparées directement par la simple mesure, par SM, de la surface des pics chromatographiques de l’acétylcholine (ACh) résiduelle, dont l’hydrolyse a été inhibée par les composés recherchés. 3 étalons connus d’inhibiteurs d’AChE (la galanthamine-GL, l’huperzine A-HuA et la tacrine-TA), ont été sélectionnés pour mettre au point les conditions analytiques de ce couplage original. Après avoir validé cette méthode avec les 3 étalons inhibiteurs de l’AChE, les extraits alcaloïdiques de différentes plantes ont été injectés dans le dispositif afin de cribler les nouveaux candidats inhibiteurs de l’AChE. Parmi les extraits injectés, il y des inhibiteurs d’AChE ont pu être découvert grâce à la présence des pics d’ACh. Pour compenser la dérive de la ligne de base chromatographique (m/z 146), due au gradient de phase organique (MeOH), une pompe de contre-gradient a été ajoutée à la sortie de la colonne de CLHP. Les résultats montrent que cet ajout d’une pompe de contre-gradient améliore considérablement l’horizontalité de la ligne de base mais relève celle-ci à des valeurs trop importantes et réduit d’autant la sensibilité du dispositif par rapport à la méthode chromatographique réalisée sans contre-gradient. Cette étude a permis la mise au point d’une méthode innovante en couplant la CLHP, un IMER et une détection par SM destinée au criblage les inhibiteurs de l’AChE. Grace à cette méthode, l’activité des différents inhibiteurs peut être facilement évaluée en mesurant l’aire des pics d’ACh correspondant aux composés recherchés. 3 inhibiteurs connus de l’AChE ont été choisis pour valider cette méthode. Cette dernière a permis de mettre clairement en évidence une relation dose-effet croissante qui lie des pics des inhibiteurs de l’ACh en fonction de leurs quantités injectées. Cette méthode CLHP-IMER-SM a été appliquée au criblage les inhibiteurs de l’AChE dans des extraits de plante. Grâce à cette méthode, un nouvel inhibiteur de l’AChE a été découvert dans l’extrait de Lycoris Radiata.
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Identifiants

  • HAL Id : tel-02965518 , version 1

Citer

Ye Yuan. Mise au point d'un système chromatographique permettant de détecter en ligne la présence d’inhibiteurs de l’acétylcholinestérase et de comparer qualitativement leurs activités inhibitrices. Chimie analytique. Université de Strasbourg, 2019. Français. ⟨NNT : 2019STRAF016⟩. ⟨tel-02965518⟩
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